TINCION SUPRAVITAL CON AZUL DE METILENO .

MATERIAL:

Microscopio óptico. 
portas y cubres.
Tubos de hemolisis.
Pipeta Pasteur.
Papel parafilm.
Matraz Aforado 

REACTIVOS:
Azul de Metileno.

Oxalato potásico.

Agua destilada.

MUESTRA:
Sangre capilar fresca o Venosa anticoagulada.

 FUNDAMENTO: Tiñe los núcleos celulares.

TÉCNICA:

• Preparamos el colorante :

1. Azul de Metileno 0,5g.
2. Oxalato potasico 1,6g.
3. Agua destilada 100ml.

• En un Matraz aforado vertemos el preparado de colorante ,agitamos la mezcla durante un minuto .. cogemos el tubo de hemolisis y vertemos dos gotas de sangre y dos gotas del preparado.
  
  
  
  
  
  
• Tapamos con papel parafilm el tubo de hemolisis y dejamos reposar a temperatura ambiente la mezcla durante 10 minutos.
• Al cabo de ese tiempo aspiramos con la ayuda de la pipeta pasteur uno o dos gotas de la mezcla y la depositamos en el portaobjetos 
• Cubrimos la mezcla del portaobjetos con un cubre .
• Observamos la preparación con el microscopio óptico con el objetivo de 40x.

RESULTADO:

La observación al microscopio debe ser rápida ya que las células no tienen un periodo de vida larga.

Podemos observar los núcleos celulares teñidos .

hoja de trabajo:

¿ En que se diferencia una tincion vital de una supravital? la vital tiñe las células de dentro de la celula y la supravital tiñe los tejidos o organos fuera del organismo.

¿Cuales son los colorantes vitales mas utilizados?   ROJO NEUTRO.

¿Que tipo de estructuras tiñe selectivamente el verde Jano? TIÑE MITOCONDRIAS Y OTROS ORGÁNULOS CELULARES.

¿Cuales son las ventajas de una tincion supravital? QUE SE OBSERVAN LOS ÓRGANOS O TEJIDOS FUERA DEL ORGANISMO.

¿Cuales son los incovenientes? QUE SI NO SE OBSERVA RAPIDAMENTE ,LAS CÉLULAS PUEDEN MORIR.

PREPARACIÓN DE GOTA GRUESA:

MATERIAL :

• Un tubo capilar heparizado.  si la muestra es capilar, o no heparizado, si la muestra es sangre venosa anticoagulada.
•  Una Pipeta Pasteur.
• 2 Portaobjetos
• 2 Cubetas de tincion con sus reactivos cestillos.

REACTIVOS:

• Metanol
• Agua destilada 
• soluccion Giemsa al 3% en agua destilada.

MUESTRA:

Sangre capilar o venosa anticoagulada con heparina o EDTA.

FUNDAMENTO:

Cuando se observa frotis sanguíneo fino para confirmar un diagnostico de paludismo,debe prestarse atención a los hematíes infectados y a los parásitos que dentro de ellos.

En las preparaciones de gota gruesa ,los hematíes están lisados por lo que el diagnostico de paludismo se basa en el aspecto de los parásitos que puedan encontrarse.Ademas en estas preparaciones ,los parásitos palúdicos suelen ser mas abundantes y compactos que en las extensiones finas.

TÉCNICA:

1. Hacemos un frotis de una gota de sangre ,colocando la gota en el centro del porta.
2. Depositamos tres gotas de sangre en el extremo derecho formando un triangulo ,con ayuda de otro porta limpio unir las tres gotas formando una sola gota.
3. Dejar secar la muestra en forma horizontal. 
4. Fijar la extensión.
5. Dejar secar la gota gorda durante 24 horas.
6.  Al día siguiente, volver a verter la muestra en una solución Giemsa en una cubeta de coloración. 
7. Colocar  el porta en el cestillo de la cubeta de coloración que contiene colorante.
8. Sumergir la preparación, en la gota gruesa,durante 30-45 minutos.
   
9. Verter agua limpia en otra cubeta y aclarar la muestra varias veces.
10. Dejar secar la muestra en forma vertical.

RESULTADO:

Cuando el enfermo estudiado padece un paludismo,en la extensión fina pueden encontrarse distintas formas evolutivas de los parásitos palúdicos,tanto en interior de los hematíes como fuera de ellos.

CICLO PLASMODIUM: 

                                                        foto de google.

HOJA DE TRABAJO:

¿Que colorante se utiliza para teñir la preparación de gota gruesa?

-GIEMSA.

¿Como están los hematíes en la preparación de gota gruesa?

-

¿Con que sustancias se fija la preparación de gota gruesa?

-METANOL.

RESULTADOS OBTENIDOS:

No se observan parásitos palúdicos.

TINCION DE WRIGHT.

MATERIAL :

• Microscopio.
• Cristalizador.
• Puentes de tincion.
• Pipetas pasteur con chupete.
• Frasco lavador.
• Tubos de ensayo.
• 

REACTIVOS:

Solución de eosina-azul de metileno según wright.

Solución tampon PH 7.2.

Aceite de inmersión.

MUESTRA:

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada . Los anticoagulantes mas adecuados son la heparina y el EDTA.

TECNICA:

1. hacer un frotis sanguineo,dejar secar al aire.
2. Colocamos horizontalmente en el puente de tincion y verter 1ml de azul metileno. Dejamos actuar 1 minuto y lavamos con tampon 7.2 y dejamos secar verticalmente.
3. En un tubo de ensayo diluimos 5 gotas de reactivo de wright y 5 gotas tampon de ph 7.2.mezclamos bien, teñimos la muestra dejar actuar 3-5 minutos lavamos con agua del grifo , lavamos con tampon hasta que deje salir teñida el agua ,dejamos secar horizontalmente

RESULTADOS:

Depositamos una gota de aceite de inmersion y observamos con el objetivo 100 x.

Las células que se observan son : eritrocitos, neutrofilos , eosinofilos  ,basofilos ,monocitos  y linfocitos.

HOJA DE TRABAJO:

¿Que tipo de colorante usamos en esta tincion?

-colorante de wright

¿Que solución empleamos como fijador?

-solución tampon 7,2

¿Cuanto tiempo debe estar en contacto el frotis con el colorante diluido?

-3-5 minutos.

TINCION DE GIEMSA :

-MATERIAL: 

• Microscopio 
• Portas
• Cristalizador
• Puentes de tincion 
• Pipetas pasteur con chupete
• Frascos lavadores
• Tubos de ensayo 
  

-REACTIVOS:

1. Colorante en solución según Giemsa 
2. Solución tampon 7.2 
3. Metanol
4. Aceite de Inmersión.

-MUESTRA:

Sangre capilar o venosa anticoagulada.

- TÉCNICA:

• Preparamos una extension de sangre .
• Colocamos el frotis sobre el puente de tincion, en el cristalizador y en posicion vertical.
• Cubrimos la extension con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y los dejamos secar.
• Diluimos en un tubo de ensayo 0.2 ml de Giemsa con 2 ml de tampon 7.2.
  
• Mezclamos suavemente en un tubo y con una pipeta pasteur cubrimos el frotis con la dilucion de colorante ,dejando actuar 25 minutos. 
• Escurrimos y lavamos con agua de grifo, despues lavamos con tampon 7.2 hasta que deje de salir el liquido teñido . dejamos secar en posicion vertical.
• Una vez secado , depositamos una gota de aceite en el porta y observamos al microscopio con el objetivo 100x .

-RESULTADOS:

Se observan los eritrocitos de color rosado, y plaquetas color violeta

Los neutrofilos de color azul  violeta en el nucleo,y citoplasma de color rosa y granulaciones de cojor rojo.

Los eosinofilos se observa un nucleo de color azul violeta ,citoplasma azul y granulos de color anaranjado.

Los basofilos de color purpura en el nucleo y granulaciones de color azul oscuro.

Los monocitos y linfocitos se observan con un nucleo de color violeta ,citoplasma de azul y un poco mas claro los monocitos.

HOJA DE TRABAJO:

1. ¿Cuales son los anticoagulantes mas adecuados para esta técnica? - Heparina y EDTA.
2. ¿Con que reactivo fijamos la extensión ? - Metanol.
3. ¿Cuanto tiempo debe actuar el colorante en la extensión? -  25 minutos.

DETECCIÓN DE CUERPOS DE HEINZ :

-MATERIAL:

• Un tubo de ensayo
• 2 Pipetas graduadas.
• Pipeta pasteur .
• Baño maria.
• 2 portas 
• Microscopio.

-REACTIVOS: 

1. Cristal violeta 20ml.
2. Suero Salino 20ml
3. Agua destilada 20ml.
4. Liquido de inmersión.
   

-MUESTRA:

Sangre capilar.

-TECNICA :

1. Mezclamos en el tubo de ensayo 5 gotas de sangre y 5 gotas de la mezcla.
   
2. Meter en baño maria a 37º durante 5 minutos.
   
3. Hacemos una extensión sanguínea.
4. Dejamos secar la extensión.
5. Observamos al microscopio ,utilizando el aceite de inmersion,con el objetivo 100 x.

-RESULTADOS:

Se observan pequeñas granulaciones de color purpura,que se localizan en la periferia de los hematíes .

HOJA DE TRABAJO:

¿Cual es el colorante usado para teñir los cuerpos de Heinz?

-Cristal violeta.

¿De que color son los cuerpos de Heinz teñidos? 

- Violeta.

¿Donde se localizan los cuerpos de Heinz?

-Se localizan en el interior y exterior de la célula.

En la muestra realizada no se han encontrado cuerpos de Heinz.
NO tiene una hemoglobina inestable.

CONTAJE DE RETICULOCITOS:

-MATERIAL:

• Microscopio
• Tubos de hemolisis
• Pipeta pasteur  con chupete
• Porta
• Baño de agua 
• Sistema de Filtración.
       

-REACTIVOS:

En clase preparemos el reactivo ,utilizando agua destilada, solución salina 80ML, citrato sódico20ML y azul cresil brillante 3%.

ACEITE DE INMERSIÓN.

-MUESTRA:

Sangre anticoagulada con EDTA.

-TECNICA:

1. Una vez preparada la mezcla ,filtramos antes de verterla en el recipiente .
2. La tincion de reticulocitos, es una tincion supravital ,que quiere decir que las células siguen vivas .
3. vertemos 3 gotas de sangre con 3 gotas de la coloración  en un tubo de ensayo , mezclamos bien y tapamos con papel para-film.
   
4. vertemos el tubo de ensayo al agua maría a 37º durante 5 minutos.
   
5. Cojemos una gota de la mezcla y realizamos un frotis fino , dejamos secar.
6. vertemos una gota de aceite de inmersión en el centro del frotis y lo colocamos al microscopio con el objetivo 100 x
   

-RESULTADOS:

Los hematies aparecen de un color verdoso y los reticulocitos se diferencian porque en el interior aparecen unos hilos de color azulado.

En adultos y niños los valores normales van de 0.5% - 1.5%

se produce reticulopenia en casos de aplasias medular, anemia ferrotipica y anemias que cursan con dificultad en la eritropoyesis.

Por el contrario hay reticulocitosis en anemia hemoliticas ,donde se aumenta el nivel de producción de hematies para contrarrestar su perdida.

La cantidad de reticulocitos expresada en % es un valor relativo referido a una cifra normal de hematíes , cuando existe una anemia con disminución en la cantidad de hematíes se compensa con un aumento de números de reticulocitos.

FORMULA LEUCOCITARIA :

-MATERIAL:

• Microscopio.
• Papel y Lápiz o registrador automático de células .
  

-MUESTRA:

Sangre capilar. 

-REACTIVOS:

Aceite de inmersión.

-TÉCNICA:

1. hacemos una extensión de sangre , después lo vertemos en el colorante habitual ,osea los 3 colores .
   
2. Enfocamos la preparación en el micro con el objetivo de 10 x.
3. Comprobamos que la preparación es buena y elegimos la zona en la que los hematíes no estén superpuestos y leucocitos estén distribuidos " osea, en el centro de la extensión".
4. Enfocar esa zona de la preparación con el objetivo de inmersión .
5. Observar esa zona de la preparación mientras se describe un recorrido en forma de zig-zag .

-RESULTADOS OBTENIDOS:

Neutrofilos segmentados   52%

Neutrofilos en cayados     8%

Eosinofilos     1%

Basofilos     1%

Monocitos 0%

Linfocitos   45%

VALORACIÓN DE LOS RESULTADOS: La proporción de leucocitos es normal

se encuentra una Neutrofilia, Eosinopenia, Basopenia, ,Monocitopenia y Linfocitosis.

HOJA DE TRABAJO:

1. ¿Con que objetivo se observan los leucocitos cuando se determina una formula leucocitaria? - 10 x
2. ¿Como es el recorrido que se describe en la observación leucocitaria? -En ZIG-ZAG
3. ¿Cuando se han de observar al menos 200 leucocitos? -Cuando se encuentra un numero mayor de linfocitos que de neutrofilos.
4. Si de 100 leucocitos observados,20 son linfocitos y el WBC es igual a 7000 leucocitos/mmcubicos de sangre, ¿Cual es el numero de linfocitos que hay en 1 mm cubico de sangre? -
5. ¿C omo se llama el aumento de los monocitos? -Monocitosis.

    

TINCION PANÓPTICO RAPIDO:

-MATERIAL:

• Cubeta de wertheim o similares.
• Cestillo para portas
  
  
  
• Frasco lavador.

-REACTIVOS:

• Solución 1: alcoholica de triarilmetano.
• Solución 2: tamponada de xanteno.
• Solución 3: tamponada de tiazina
  

-MUESTRA:

Sangre capilar.

-TÉCNICA:

1. Hacemos un frotis.
   
2. En tres cubetas o recipientes se encuentran las 3 soluciones.
3. Coger el frotis y sumergir la extensión 5 veces durante 1 segundo en cada sumergion  en cada uno de los recipientes.
   
4. Finalmente lavamos con agua destilada el frotis y dejamos secar.

-RESULTADOS:

Depositamos una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observamos con el objetivo 100 x.

Las coloraciones obtenidas en las celulas sanguineas son similares a las de la tincion de wright  y giemsa ,sin embargo , podemos variar la intensidad de la tincion modificando el numero de inmersiones en los colorantes Nº2 y Nº3.

Se observan varios componentes celulares a la vez.

HOJA DE TRABAJO:

¿En que se diferencia este método de las otras tinciones clásicas?

-

¿Cuantos segundos debe sumergirse el frotis en cada una de las soluciones?

-5 Segundos.

¿Cual cree que es la solución fijadora?

-La solución Nº1

CÉLULAS EPITELIAL VEGETAL

-MATERIAL:

un trozo de cebolla
pinzas
portaobjetos
pipeta pasteur
frasco lavador"agua destilada"
cubre
microscopio

-REACTIVOS:

Azul de Metileno o Lugol.

-MUESTRA: 

extracción de una muestra del epitelio de la cebolla.

-DESARROLLO:

Con ayuda de las pinzas obtenemos una muestra muy fina del epitelio de la cebolla, antes de poner la muestra echamos una gota de agua destilada  en el portaobjetos con ayuda del frasco lavador.
Colocamos la muestra y teñimos con Azul de Metileno, administramos calor antes y después de poner cubre.
Colocar la muestra en el microscopio y observar el resultado.

-RESULTADO:

Se observa núcleo celular y pared celular.

CÉLULAS EPITELIALES DE LA BOCA

- MATERIAL:
Bastoncillo
portaobjetos
microscopio
cubre
Frasco lavador "agua destilada"

-REACTIVO:
No usamos ningún reactivo.

-MUESTRA:
Introducimos el bastoncillo en la  boca y con suavidad recorremos con el bastoncillo el interior de la boca cogiendo una muestra de esta.

-DESARROLLO:
 Con ayuda del frasco lavador vertemos un gota de agua destilada en el portaobjetos, mojamos el bastoncillo en el agua destilada dejando ahi la muestra de epiteliales de la boca.Dejamos  secar la muestra y observamos al microscopio.

-RESULTADO:
En el microscopio se puede observar perfectamente la Membrana Plasmática, Núcleo y Citoplasma.

INTRODUCCIÓN AL MANEJO DEL MICROSCOPIO

-MATERIAL :

Microscopio
Portaobjetos
Hoja papel cuadriculada
Bolígrafo
Cinta adhesiva transparente


-PROCEDIMIENTO:
1.Descubrir el aumento de los oculares y de cada uno de los objetos del microscopio.
calcular el aumento obtenido con el uso combinado de los oculares y cada uno de los objetivos.
Reseñar los resultados obtenidos.

AUMENTO DE LOS OCULARES:10
AUMENTO DE CADA OBJETIVO: 4X, 10X ,40X ,100X.
AUMENTO COMBINADO : 40, 100, 400,1000.

2.Recortar un trozo de papel cuadriculado, de manera que tenga la forma y tamaño de un portaobjetos.

3.Enfocar de nuevo, con el objetivo de menor aumento , la zona central del signo mas. 
     sin dejar de mirar a través de los oculares y utilizando los tornillos reguladores de la platina: ¿Que letras son las visualizadas?  - Las letras IZ (izquierda).

Seguidamente,desplazar el campo microscópico hacia la izquierda ,hasta visualizar otra letra.¿Que letra es la visualizada?   -La letra D (al extremo izquierdo).

Volver a la zona central.

 Desplazar el campo microscópico hacia abajo , hasta visualizar otras letras.¿Que letras son las visualizadas?  -NI( parte inferior invertido).
¿Que consecuencias se extrae de los resultados obtenidos?   - Se ven las letras de al revés e invertidas.

4. Enfocar sucesivamente, con el objetivo de menor aumento,las letras rotuladas alrededor del signo +.
Fijándose en las escalas longitudinal y transversal de la platina,establecer la posición exacta de  cada una de esas letras. 
Anotar los resultados obtenidos .

              LETRAS                                             D     IZ      SP     IN
      COORDENADA LONGITUDINAL        13    12        3       24
     COORDENADA TRANSVERSAL         133    157   144     144,5

ESTUDIO MICROSCÓPICO DE LA CRISTALIZACIÓN DE LA SALIVA.

- MATERIAL:

Microscopio
2 portaobjetos
un pañuelo de papel

-MUESTRA:
Saliva

-TÉCNICA:
1. Limpiar un portaobjetos con un pañuelo de papel .
2.Antes de depositar la gota de saliva enjuagarse la boca,
3.Verter la gota de saliva en el portaobjetos.  y con  la ayuda de otro portaobjetos extendemos la muestra.
4. Dejamos secar la extensión .Para ello, se puede utilizar una fuente de calor.
5.Ponemos el portaobjetos sobre la platina,teniendo en cuenta que la cara de aquel que tiene la extensión ha de estar hacia arriba.
6.Enfocar la preparación,con cada uno de los objetivos del microscopio, excepto con el de inmersión.


-FUNDAMENTO:
La saliva,en presencia de una concentración apreciable de estrogenos ,cristaliza cuando se la deja secar sobre un portaobjetos.
Esta cristalización es visible microscopicamente.


-RESULTADOS:
Para la lectura de los resultados, es fundamental la observación de la muestra con un objetivo de mediano poder de ampliación .
Los cristales que se forman al cristalizar la saliva, tienen el aspecto de hojas de helecho.
La cristalización observada puede ser : clara, mediana y nula.


-INTERPRETACIÓN:

Visualización clara y abundante ,Implica que la mujer esta en una situación de fertilidad. Esto coincide con los diez días que rodean la ovulacion y suele encontrarse a lo largo del ciclo menstrual durante una semana.

Visualización de una mediana cristalización, no permite encuadrar a la mujer dentro de un estado patente de fertilidad o de infertilidad.

Visualización de una cristalización nula , Implica que la mujer esta en una situación de infertilidad .Esto suele encontrarse en la menstruación y en los días que lo rodean.

foto sacada de google.

HOJA DE TRABAJO:

1.¿Que hormonas hacen posible la cristalice la saliva? 

-Los estrogenos,

                             2. ¿Que aspecto tienen los cristales que se forman en la saliva?
                                                                    - Ramificada.     
                             3. ¿Como es la cristalizacion de la saliva en un estado de fertilidad clara? 
                                                                  -Abundante.

RESULTADOS OBTENIDOS: 
La Cristalización observada es : MEDIANA.

VALORACIÓN RESULTADOS:
La mujer se encuentra en un estado de : FERTILIDAD DUDOSA.