Electroforesis de la hemoglobina

MATERIAL : 

• TIRAS DE CELLOGEL
• RODILLO
• CUBETAS 
• FUENTE DE ALIMENTACIÓN
• PLACA DE VIDRIO
• TUBO DE ENSAYO 
• APLICADOR ELECTROFORESIS

REACTIVO:

• SUERO FISIOLÓGICO
• AGUA DESTILADA
• SOLUCIÓN DECOLORANTE (acido acetico) 
• SOLUCIÓN TRANSPARENTADORA 
• CLOROFORMO
• METANOL
• TAMPON 
• COLORANTE : NEGRO AMIDO O ROJO PUNZÓN .

MUESTRA :

Sangre venosa o capilar 

TECNICA: 

1. Vertemos 3ml de sangre y centrifugamos 10 minutos ,quitamos el sobrenadante y vertemos 4 ml de suero salino y centrifugamos 10 minutos y retiramos el sobrenadante .hemolizamos.
2. Repetimos el proceso 2 veces mas con 4 ml de suero salino y hemolizar. 
3. En el ultimo centrifugado quitamos el sobrenadante y vertemos 1.5ml suero salino, 0.5 cloroformo y con pipeta pasteur hemolizamos y meter en cetrifuga 3000 rpm durante 20 minutos. 
4. Llenamos la cubeta de electroforesis con tampon y meter tiras de cellogel durante 10 minutos 
5. Ponemos las tiras en los puentes de electroforesis el pico mirando hacia nosotros y a la derecha del cable negro .
6. La muestra ira del catado hacia el ánodo .
7. Vertemos la tira en solución colorante realizado con rojo punzón 
8. Vertemos las tiras en solución decolorante 3 lavados durante 10 minutos cada uno y después lo agitamos durante 5 minutos cada decoloración  sumergimos las tiras en metanol durante 1 minuto 
9. Vertemos la tira en solución tansparentadora durante 2-3 minutos , sacamos las tiras y las colocamos en placa de vidrio colocamos la cara absorbente boca abajo y aplastamos con rodillo .
10. Metemos en la estufa la placa de vidrio con las tiras durante 5-6 minutos a temperatura 60º hasta que la tira quede transparente.

RESULTADOS: 

LA TIRA PUEDE APARECER DE VARIAS MANERAS 

• B-TALASEMIA: ausencia de hemoglobinaB , HBA(3.5%) HBA2 (10%)ESTA ALTERADA.
• ANEMIA FALCIFORME HOMOCIGOTICA : las dos copias del gen están alteradas HBA - HBS (80-100%)
• ANEMIA FALCIFORME HETEROCIGOTICA : 1 copia esta bien y otra mal ,están casi igual  HBA(25-60%) HBS (25-60%)

CONCENTRACIÓN HEMOGLOBINA:

MATERIAL :

• 3Tubos
• Pipeta 5ml
• Micropipeta

MUESTRA: 

Sangre capilar o venosa anticoagulada. 

REACTIVO :

RT : DRAKIN

CALIBRADOR: HEMOGLOBIN CAL .

TÉCNICA: 

Preparamos los tubos y rotulamos.

1. BLANCO : 2.5 ml drakin
2. PATRÓN : 2.5 ml drakin + 10 microlitros calibrador
3. MUESTRA : 2.5 ml drakin + 10 microlitros sangre. 

Homogeneizamos con agitador durante o esperar en temperatura ambiente durante 5 minutos 

Metemos en espectofotometro a 540 nm y sacamos la concentración de la muestra . 

calculamos : (A) MUESTRA  / (A) PATRÓN X 15 g/dl.

FUNDAMENTO:

La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en ciametahemoglobina. 

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada .

RESULTADO :

Hombre: 14-18g/dl

mujer: 12-16 g/dl

SIGNIFICADO CLÍNICO:

Cuando los niveles HB aparece bajo indica anemias primarias , cáncer, embarazo , enfermedad renal o hemorragias. 

ascenso de HB se debe a cardiopatias , desidratacion o estancia en lugares de gran altitud .

HIERRO

MATERIAL:

• Pipeta 
• 4 Tubos de ensayo 
• Micropipeta 
• Vaso precipitado
• Espectofotometro

REACTIVO:

RT: COMPUESTO POR R1-R2

R3: COLOR 

PATRÓN :ION CAL 

MUESTRA:

Suero sacado de sangre fresca.

TÉCNICA:

• En cada tubo de ensayo vertemos las cantidades indicadas , no olvidar rotular los tubos.

1. TUBO1 (BLANCO RT): 1ML RT , 1 GOTA R3, AGUA DESTILADA 200MICROLITROS.
2. TUBO2  (PATRÓN):1MLRT, 1 GOTA R3,200MICROLOTROS ION CAL.
3. TUBO3 (BLANCO MUESTRA) : 1ML RT , 200MICROLITROS SUERO
4. TUBO 4 (MUESTRA) : 1ML RT , 1 GOTA R3 , 200MICROLITROS SUERO 

• Dejamos reposar 10 minutos a temperatura ambiente o baño maría a 37º durante 5 minutos.
• Leemos las absorbancias (A)del patrón y la muestra frente al blanco de reactivo:

MUESTRA - BLANCO MUESTRA / PATRÓN X 100 

FUNDAMENTO :

Determinar la concentración de hierro en sangre . El hierro se disocia del complejo serico hierro-tranferrina en un medio ácido débil . El hierro es libre se reduce a ion ferroso mediante el ácido ascorbico .

LECTURA RESULTADOS : 

El hierro es necesario para la producción de hemoglobina su descenso produce anemia ferropenica . se encuentra niveles elevados de cirrosis, hepatitis aguda y en concentraciones elevadas de tranferrina. el diagnostico clínico debe realizarse según todos los datos clínicos y del laboratorio.

VALORES DE REFERENCIA: 

HOMBRES: 65-175 microlitro/dl

MUJERES: 40-150 microlitro /dl 

cada laboratorio ejerce sus propios valores de referencia.

DETECCIÓN DE CRIOGLOBULINAS.

FUNDAMENTO:
Se basa en la exposion del suero problema a la accion de una temperatura baja. si el suero problema contiene crioglobulinas ,estas precipitan con el frio y el precipitado formado adopta el aspecto de particulas blanquecinas.

MATERIAL:

• Pipeta pasteur 
• Tubo de ensayo.
• Gradilla.
• Nevera.
• Baño agua
• Capilar hematorito 
• Plastilina
• Centrifuga microhematocrito
• Regla o Microhematocrito.

MUESTRA:

Suero obtenido de la centrifugacion de sangre.

TÉCNICA:

1. Depositar el suero en un tubo de ensayo.
2. Colocamos el tubo que contiene el suero en una nevera a temperatura 4- 6ºC.
3. Examinamos el tubo a los 30  minutos después.

LECTURA RESULTADOS:

• Si aparecen partículas blanquecinas en el suero, este ha de ser incubado a 37 durante 5 minutos.Si no desaparece después consideramos que se deben a restos de fibrina,y si desaparece se estima que son crioglobulinas precipitadas.
• El grado de positividad se establece por el aspecto (casi turbio,turbio,lechoso) y el grado de positividad (+,++,+++)
• si la prueba da positivo ,realizaremos la determinacion de criocrito.

1. Llenamos el capilar con el suero las 3/4 partes.Sellamos el extremo con plastilina.
2. Enfriamos el tubo hasta que aparece precipitacion de las crioglobulinas.
3. Centrifugamos en microhematocrito a 12000 rpm a 5 minutos.
4. Calculamos el precipitado con regla o micrihetocrito.

La practica echa en clase no aparecían partículas blanquecinas.

El resultado lo calcularíamos :

HCT=E X 100 / T .

INTERPRETACIÓN  CLÍNICA: 

CRIOGLOBULIAS.

TIPOI: Trastornos proliferativos.

TIPOII: Idiopaticas o secundarios , diferentes enfermedades.

TIPOIII: Infecciones sistematicas y procesos autoinmunes.

MANIFESTACIONES CLÍNICAS:

• ELEVADA VISCOSIDAD: Conduce a una estasis sanguínea en algunos vasos corporales y aparece en trastornos isquemicos.
• PRECIPITACIÓN CRIOGLOBULINAS: Origina una obstrucción vascular que puede ocasionar una arocianosis.
• DEPOSITO DE INMONOCOMPLEJOS: Puede ser causa de la aparición de daños renales o articulares.

DETERMINACIÓN DEL VALOR HEMATOCRITO MEDIANTE EL MICRÓMETODO.

MATERIAL:

• Tubos capilares de vidrio 
• Plastilina
• Algodón  o gasas.
• Una centrifuga de microhematocrito.
  
• Una regla  milimetrada o un lector de microhematocrito.

REACTIVOS: EDTA.

MUESTRA:

sangre capilar o venosa . esta debe ser recogida en tubo con edta .

si se usa sangre capilar se ha desechar la 1º gota tras la punción. Si se emplea sangre venosa, se deberá homogeneizar antes de su uso .

FUNDAMENTO:

El hematocrito  puede determinarse por métodos manuales o por métodos automáticos.

Los métodos manuales consisten en la centrifugacion de la sangre ,aplicando una fuerza de 2000 a 5000 o 12000 a 15000.

los métodos automáticos pueden basarse en 2 principios:

• El calculo del hematocrito a partir de los valores de RBC y de volumen corpuscular medio , obtenidos electromecánicamente con anterioridad.
• El análisis de la sombra que produce la población eritrocitaria, al reflejarse en un campo oscuro .

TÉCNICA: 

1. La determinación ha de hacerse por duplicado
2. Llenar cada tubo capilar con la sangre ,hasta las 3/4 partes de su longitud . El llenado se efectúa por capilaridad y se realiza poniendo en contacto uno de los extremos del tubo capilar con la gota de sangre, o introducirlo en el tubo de sangre e inclinando este, para facilitar el proceso.
3. Limpiar el exterior de cada tubo con un trozo  de algodón o gasa. 
4. Sellar el extremo de cada tubo por donde a entrado la sangre con plastilina.
5. Colocar equilibrados los tubos en la centrifugadora . En ella los tubos se sitúan con su extremo tapado hacia afuera y colocandolo en sus surcos hasta que queden bien sujetos.
   
   0
6. Centrifugar los tubos a unas 1200 RPM durante 5 minutos.

LECTURA DE RESULTADOS:

Puede realizarse de 2 maneras:

• Midiendo las columnas formadas en el interior de cada tubo con una simple regla milimetrada y calculando el porcentaje que le corresponde a la columna de eritrocitos, mediante una sencilla regla de tres.
• Mediante un lector de microhematocrito.
  
  
  
  
  

Entre los valores obtenidos con los dos tubos no debe haber una diferencia superior al 2% del mayor de ellos.

Si esta diferencia es superior al 2% se repite la determinación y si es inferior se da como valor final la media de ambos tubos.

Si el valor final de hematocrito es superior a 50 se repite la determinación pero alargando el tiempo de la centrifugadora a 10 minutos.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS:

El valor normal del hematocrito esta comprendido entre el 42% y el 47% en las mujeres y 
.entre el 45 %y 52% en los varones.

Un valor bajo de HCT suele ser signo del padecimiento de una anemia . Sin embargo hay falsos descensos del HCT ocasionando por hemodilucion .

El hematocrito suele ser normal en la fase mas temprana de las hemorragias agudas, pues en estas se pierden células y plasma en la misma proporción.

Un valor alto de HCT suele ser signo del padecimiento de una poliglobulina. Sin embargo también hay engañosos ascensos del HCT producidos por hemoconcentración.

RECUENTO DE HEMATÍES.

MATERIAL:

• Pipeta diluidora de Thoma ,para recuento de glóbulos rojos.
• Un tubo de goma con boquilla,adaptable a la pipeta diluidora.
• Una cámara de recuento, con un retículo tipo Neubauer mejorado.
• Un cubre.
• Microscopio.
  

REACTIVOS:

Liquido de dilucion . Este debe ser isotónico con el plasma, para evitar la alteración morfológica e incluso la lisis de los hematíes.

El mas utilizado es HAYEM.

Si contiene precipitados, antes de usarlo se debería de filtrar.

MUESTRA:

Sangre obtenida por punción del pulpejo de un dedo o sangre venosa procedente de una punción  venosa y anti coagulada con  EDTA.

FUNDAMENTO:

Para el recuento en cámara de glóbulos rojos, se diluye la sangre problema en un liquido apropiado y posterior se deposita en la cámara de recuento , donde se cuentan las células presentes en algunos cuadrados de uno de los retículos. 

TÉCNICA:

1. Situar un cubre sobre el retículo de la cámara. Para facilitar su adhesión a esta , se ejerce una ligera presión al tiempo que se desliza el cubre sobre las bandas laterales ,Humedecemos con agua de su porción central.
2. Aspiramos la sangre hasta 0.5 si creemos que es policitemia. o 1ml si pensamos que sufre anemia.
3. Limpiar con cuidado el exterior de la pipeta con un algodón y sin hacer bajar el nivel de sangre.
4. Aspirar liquido diluyente hasta la  señal 101.
5. Desechar el tubo de goma de la pipeta y homogeneizar el contenido del bulbo.Para ello se sujeta la pipeta del extremo, con los dedos pulgar e indice y se agita suavemente en sentido horizontal durante 2 o 3 minutos.
   
6. Desechamos las 3 primeras gotas, ya que contienen liquido presente en el tubo capilar largo de la pipeta Thoma, que no esta mezclado con la sangre.
7. Depositar la siguiente gota entre la cámara y el cubre . Esto se realiza hubicandola en uno de los bordes adheridos del cubre y dejándola que entre por capilaridad en el espacio existente entre ambas estructuras,hay que evitar que se formen burbujas y que rebose la sangre por fuera de los bordes del cubre.
   
8. Dejar reposar la sangre diluidora contenida en la cámara durante unos minutos para que las células presentes sedimenten.
9. Enfocar el retículo con el objetivo de 40 x y con el condensador a baja altura , verificar que la distribución de los hematíes es homogénea.
10. Contar los hematíes presentes en 80 cuadrados pequeños del cuadrado grande central.

LECTURAS DE RESULTADOS:

Como se cuentan los hematies presentes en 5 cuadrados medianos del cuadrado grande central , y este tiene 25 cuadrados medianos, multiplicamos x5 la cifra obtenida en el recuento, para calcular el numero de hematies qur hay en un cuadrado grande.

Como la longitud de cada uno de los lados del cuadrado grande central es 1mm y de longitud entre el cubre y este es de 0.1 mm , multiplicaremos x 10.

Como la sangre,se diluye hay que multiplicar el resultado anterior por 100, solo cuando la sangre sea 1mm.

RBC= H x 5 x 10 x D   

RBC... recuento de hematíes.

H ... hematíes contados en 5 cuadrados medianos.

D.... factor de dilucion..

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS:

La disminución del RBC se produce en las ANEMIAS y su aumento se da en las POLICITEMIAS.

Se considera normal un RBC comprendido entre los 4 y  los 5.5 millones / mm cúbicos en las mujeres y entre los 4.5 y los 6 millones /mm cúbicos en varones.

RECUENTO DE PLAQUETAS CON HEMOCITROMETRO

MATERIAL.

• Tubo de ensayo 
• Pipeta de thoma gliobulos rojos
• tubo de goma boquilla roja 
• gasas
• camara recuento 
• cubre,microscopio,placa pletri, papel de filtro

REACTIVO:

1. Agua destilada
2. Sprinreact

MUESTRA:

Sangre venosa 

TECNICA:

1. Verter en el tubo 1 ml de l reactivo 
2. Con la pipeta thoma cogemos hasta la señal 1 
3. Limpiamos co las gasas ,Aspiramos el reactivo hasta la señal 101
4. Agitar la pipeta durante 5 minutos ,Desechamos las 5 primeras gotas
5. Poner la muestra en la camara neubauer
6. Recortar un circulo de papel de filtro y humedecemos con agua el papel y poner dentro de la de petri ,metemos la camara durante 15 minutos
7. Colocamos la camara en el microscopio y enfocamos 10x
8. Enfocamos uno de los cuadros granes con 40x y contamos las plaquetas de ese cuadro.

LECTURA DE RESULTADOS:

• Se efectua dilucion menor de la muestra y contar los trombocitos de varios cuadros
• Se efectua dilucion mayor de la muestra 

PLT/MM CUBICOS = P X V X D .

RECUENTO DE LEUCOCITOS

MATERIAL:

• Pipeta thoma o micropipeta
• tubo con boquilla roja
• cámara de recuento de neubauer
• cubre
• microscopio.

REACTIVO:

Turck - 475microlitros.

MUESTRA:

Sangre venosa -25 microlitros

TÉCNICA:

1. Seguimos el mismo proceso de recuento de hematies .Aspiramos si utilizamos pipeta thoma 1 de sangre y 101 de turck 
2. Si lo realizamos con micropipeta tomaremos 475 mirolitro de turck y 25 microlitros de sangre.
3.  Homolizamos la sangre 2-3 minutos.
4. Desechamos las tres primeras gotas y vertemos la sangre en el porta y dejamos reposar 1 minuto.
5. Enfocamos con el microscopio 40X .

FUNDAMENTO:

Sirve para determinar la cantidad de leucocitos en una cantidad de sangre.

RESULTADO:

Contamos los 4 cuadros grandes para calcular los leucocitos.

        WBC=L/4 X 10 X D

INTERPRETACIÓN CLÍNICA:

• Si hay un DESCENSO se produce leucopenias, si hay un AUMENTO se produce leucocitosis.
• Se considera un nivel normal un WBC comprendido entre 5000-11000 leucocitos /mm cúbicos.